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AAV基因治療火熱，CMC是重點：AAV生產制備中空殼率檢測方法
注：本文不構成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫療健康相關藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及）。因水平有限，錯誤不可避免，或有些信息非最及時，歡迎留言指出。此文僅用于向醫療衛生專業人士提供科學信息，不代表平臺立場。任何文章轉載需得到授權。
近日國內AAV基因治療領域群情振奮，4月19、20日國家藥品監督管理局藥品評審中心（CDE）相繼公布了兩款AAV基因藥物的臨床試驗申請獲批公示。其中一款候選藥物是朗信生物旗下上海朗昇生物科技有限公司（以下簡稱“朗信生物”）自主研發的LX101注射液，用于治療RPE65雙等位基因突變相關的遺傳性視網膜變性；另一款是上海天澤云泰生物醫藥有限公司 （以下簡稱“天澤云泰”）研發的VGB-R04 注射液，用于治療B型血友病。作為朗信生物和天澤云泰的CDMO合作伙伴，VGB-R04和LX101項目的親歷者與見證者，宜明細胞與有榮焉?。?strong style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; visibility: visible;">作者注：兩個項目中宜明細胞提供了CDMO全程服務，包括菌種庫構建、GMP質粒開發生產、GMP AAV開發生產、方法學開發檢測以及穩定性研究等。）
這兩個IND的獲批，再次將AAV置于聚光燈之下。AAV因其免疫原性極低、安全性高、宿主細胞范圍廣、擴散能力強、表達穩定以及特異性強等優勢，一直受到基因治療領域青睞，同時，AAV載體生產制備過程中質量穩定性、純度也越來越受到人們的重視。
AAV載體由兩部分組成：二十面體樣的衣殼及其包裹著的單鏈轉基因DNA。在AAV載體組裝過程中，會產生三種衣殼：完整衣殼（full capsid）、部分衣殼（partial capsid），和空衣殼（empty capsid）。其中完整衣殼包含正確的DNA序列，是人們所期待的產品；部分衣殼和空衣殼則屬于生產中的雜質，有如下幾種危害：1), 不僅僅影響產品的純度，2), 還會增加最終產品的免疫原性，3), 并且會與完整衣殼競爭感染細胞上的載體結合受體，從而抑制完整衣殼的轉導，增加總體病毒載量。部分衣殼與空衣殼地存在嚴重地影響了AAV產品的安全性和有效性，因此監管機構強烈建議在整個生產過程中監控空/完整衣殼比（空殼率）。
圖1 ：AAV制備過程中所產生的病毒顆粒類型（圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010）
但是如何測量空殼率不僅僅是AAV商業化生產的一個難點，也是藥學研究一個難點。宜明細胞深耕基因治療領域十余年，致力于細胞與基因治療技術的開發和應用，是AAV載體制造的專家。為了保證AAV產品的安全性、批次一致性、確定劑量等關鍵質量屬性，宜明細胞打造了一個高精準度、全面的（可覆蓋各個血清型）、可實現相互驗證的AAV空殼率檢測平臺，實現了AAV一站式自主檢測，降低空殼率檢測成本并且極大地縮短了檢測周期。
本平臺應用多種技術表征空衣殼的含量，主要包括透射電鏡（Transmission Electron Microscopy ，TEM）、離子交換色譜法（Anion-Exchange Chromatography ，AEC）、分析超速離心技術（Analytical UltraCentrifugation AUC），以及qPCR、酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）、光密度法（Optical Density, OD ）等常用 的技術。我們將重點進行介紹。
透射電鏡（Transmission electron microscopy，TEM）
TEM是比較常用的測定空殼率的參考方法，也常常用于識別聚集物、變形衣殼和非衣殼顆粒（如宿主細胞碎片）。TEM是利用加速電子束通過電磁透鏡穿透樣品，聚焦生成納米級分辨率圖像。TEM使用陰性染色，觀測樣品為亮，背景為暗。對于AAV (直徑約25 nm)來說，樣品圖像中染色衣殼、部分染色衣殼和未染色衣殼分別代表空衣殼、部分完整衣殼和完整衣殼。
圖2｜TEM圖像：AAV空殼率10%。空衣殼呈現一個中心有黑暗點的亮環；完整衣殼呈現出中心明亮的顆粒狀病毒；部分衣殼顯示中心稍微偏暗（數據源自：宜明細胞）
TEM常用于檢測AAV樣品空殼率、聚集和純度等指標。這一方法樣品制備簡單，可直接目視檢測，但是也存在局限性。TEM只應用于純化后的樣品，樣品中的蛋白質和細胞碎片會干擾TEM圖像中AAV衣殼的準確識別。TEM依賴于人工視覺識別進行量化。為了統計學的顯著性，工作人員必須對數千個衣殼進行成像和分析（單個圖像的衣殼含量變化約為2%）。另外，顆粒部分填充以及染色不均勻會無法清晰識別各類衣殼亞種。因此，在宜明細胞，TEM的結果常用于參考數據，與其他正交驗證方法（AEC、AUC等）一起評估。
陰離子交換色譜法（anion-exchange chromatography，AEC）
AEC可以用于多種血清型空衣殼顆粒和完整衣殼顆粒的分離。因為不同血清型的衣殼所帶的負電荷，與包裝了完整基因組DNA后的病毒顆粒所帶的負電荷有差異，導致不同的衣殼亞種之間的等電點不同。AEC就是基于這一差異在正電荷固定相上進行樣品的分離。應用紫外檢測器的AEC具有較高的重復性(<1% ~ 4% CV)和中等精確度(2% ~ 5% CV)，其精確度可以通過與TEM和AUC測試結果相比較來評估，但是受限于檢測器的靈敏度，樣品濃度不得低于1011 vg/mL。因此如果樣品濃度足夠，AEC的高通量和可重復性非常適于在工藝開發中常規使用。將AEC應用于HPLC系統（需配備OD/FS檢測器），可檢測洗脫液的含量比，是宜明細胞AAV下游生產工藝中最主要的純化方式之一。不過AEC分辨率還有待提高，空衣殼、部分完整衣殼和完整衣殼的基線分離仍未解決。
圖3｜AEC分離空殼與完整衣殼（數據源自：宜明細胞）
分析型超速離心技術（Analytical Ultracentrifugation，AUC）
AUC是表征生物大分子特性、研究生物分子理化性質的主要技術手段，也是目前能夠精確表征AAV病毒顆粒特性，測定聚合物，量化空衣殼、部分完整衣殼和完整衣殼的相對含量的重要手段之一。因其遠高于其他技術手段的數據分辨率，AUC被業界視為檢測空殼率的金標準。近期宜明細胞斥巨資為蘇州/濟南基地購置了Optima AUC，便于產品空殼率檢測，以及細胞培養條件的優化。
AUC可以通過紫外線吸收或Raleigh干涉實時掃描離心過程中樣品各個組份的分布狀態，通過分析其隨時間的變化過程，以計算出不同組分的沉降系數。然后再依據空殼病毒與全病毒顆粒沉降系數的不同，精確地測定出AAV載體的空殼率。AUC同時可以檢測中間產物、病毒載體碎片、基因組碎片、病毒聚集體等。
圖4｜AAV樣品的AUC沉降系數分布（數據A源自：DOI: 10.1016/j.omtm.2019.09.006；數據B源自：宜明細胞）。圖中各字母代表含義：E （Empty capsid），空衣殼 60s；P （partial capsid），部分完整衣殼60-100s；F, 完整衣殼（Full capsid）100s；X, 不明物
AUC在定量含量比方面有顯著優勢，一是可重復性高，變異系數（coefficient of variation， CV）僅為2%；二是分辨率高，可有效區分部分完整衣殼、空衣殼和完整衣殼。但是AUC也有自身的限制。 首先只能用于無殘留雜質或賦形劑的純化樣品的檢測。其次檢測樣品用量很大，比如樣品滴度須在2 ～5 × 1012 cp/mL（CP：capsid particle）物理滴度水平上進行以及400-500 μL的使用量，這在生產的早期階段無疑是不小的損失。另外AUC測試用時較長，通常在6小時左右，而且每次只能測試3個或者7個樣品，因此在工藝開發過程中常規使用AUC也是極具挑戰性的。事實上，AUC非常適合作為正交方法來驗證其他更快但是分辨率較低的方法，比如AEC。
另外 qPCR作為分子生物學實驗的常規技術，常用于量化AAV載體基因組的滴度。ELISA是通過底物酶促反應顯色來測定衣殼蛋白的滴度。這兩種技術應用廣泛，但是都屬于間接檢測，不能準確定量。 OD通過測量260 nm和280 nm處核酸和蛋白的吸收來定量衣殼蛋白的滴度和AAV載體的含量比。OD法精確度和重復性不高，因此數據僅用于參考。
綜上所述，在AAV空殼率的檢測過程中每種量化含量比的方法都要在通量和分辨率之間進行權衡。在快速的高通量方法中，AEC是最具前景的。TEM則可以提供更直觀的數據。在高分辨率的方法中，AUC獨領風騷，是目前唯一可行的、可定量部分完整衣殼的“金標準”。AUC 可提供高分辨率AAV樣品分析信息，可實現定量鑒別空心、實心、部分實心顆粒及聚集體。宜明細胞的空殼率檢測平臺將三種檢測方法相互結合參照驗證，全面表征AAV產品，全面提高空殼率方法學驗證能力和放行檢測的速度，確保高品質AAV產品的持續穩定供應；同時可以為業內類似產品提供檢測服務。
今年三月，宜明細胞的蘇州基地生產已正式啟用，擁有近萬平米的GMP廠房，符合國際一流標準的CGMP生產線數十條，原核發酵規模為10L-50L-200L，真核細胞培養規模為50L-200L-500L-2000L。
更先進： AAV病毒滴度產率高達1E14VG/L；
更安全：領先的方法學開發驗證及檢測能力；
更高遠：全面為CGT企業提供CDMO整體解決方案，助力基因治療產業蓬勃發展。
初心如磐，篤行致遠，宜明細胞將不斷踐行初心，讓良藥更快惠及患者！
Ubrigene， Serve with hearts！
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