注：本文不構成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫療健康相關藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及）。因水平有限，錯誤不可避免，或有些信息非最及時，歡迎留言指出。此文僅用于向醫療衛生專業人士提供科學信息，不代表平臺立場。任何文章轉載需得到授權。
前言
寡核苷酸藥物（Oligonucleotide）是一類由幾十個核苷酸組成的，序列較短的核酸分子。其主要是通過基因沉默抑制靶蛋白的表達從而實現治療疾病的目的。
與傳統藥物相比，寡核苷酸藥物具有多重技術優勢，包括：（1）特異性高；（2）高效性；（3）長效性，降低給藥頻率；（4）研發周期短，臨床轉化與研發成功率相對較高；（5）靶點豐富，適應癥廣等。目前人工合成的寡核苷酸藥物分類如圖1所示。其中反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾 RNA（siRNA）為臨床中開發的寡核苷酸藥物的主要形式。全球首款反義核酸藥物于1998年獲批上市，開啟了寡核苷酸藥物上市的征程；全球首款siRNA藥物Patisiran于2018年獲批上市，更具有里程碑意義，近兩年來已有四款siRNA藥物陸續獲批上市。截止2021年，據統計全球已有十五款寡核苷酸藥物獲批上市（如圖2），有超過400個化合物處于研發階段。除Spinraza作為孤兒藥在中國獲批上市外，暫時無其他產品在國內上市。
寡核苷酸生物分析
目前寡核苷酸生物分析方法主要有HPLC、LC-MS、ELISA、RT-qPCR等，本文主要介紹基于LC-MS技術在寡核苷酸藥物生物分析中的應用。
在生物基質中，含有各種復雜成分其中包括蛋白質，磷脂，大量鹽類以及其他有機和無機物質等，在使用LC-MS進行檢測會產生比較明顯的基質效應。此外寡核苷酸藥物經過修飾后，有較高的血漿蛋白結合率，因此為使LC-MS分析能夠順利進行，需要在樣品預處理階段去除生物樣品中的鹽和蛋白質。一般常規樣品前處理主要包括蛋白質沉淀（PPT），液液萃?。↙LE）和固相萃?。⊿PE）。PPT雖然操作簡單迅速，成本低，但由于回收率低，存在明顯的基質效應，所以基本上不推薦使用這種方式進行前處理。一般采用LLE、SPE，或者LLE和SPE聯合使用，可以獲得較高的回收率，同時降低基質效應的影響。
LLE法在寡核苷酸提取過程中屬于常見的一種提取方式，比較常用的萃取劑為苯酚-氯仿，在此基礎上也可以進行優化，比如加入異丙醇進行沉淀，去除基質中蛋白降低基質效應。同時也需要根據化合物性質，調節pH值，比如加入氨水等，來提高寡核苷酸藥物在水相中的溶解性。另外還可以使用RNA提取試劑Trizol來提取寡核苷酸，提取過程如圖3所示。
SPE法是提取寡核苷酸藥物使用最廣泛的處理方式。固相萃取的方法與色譜分離的原理相同，由于寡核苷酸藥物極性很大，保留差，在在固相小柱活化和淋洗的過程中均需要使用離子對試劑緩沖液才能達到保留寡核苷酸和洗脫干擾基質的目的。目前市面上也有非常成熟的提取寡核苷藥物的試劑盒，例如Clarity™OTX™萃取方案可有效去除掩蓋目標寡核苷酸并影響分析結果的細胞碎片，包括蛋白質、基因組DNA和脂質。通過去除這些污染物，MS基線噪音可顯著降低，從而簡化定量生物分析的過程。SPE前處理示意圖如圖4所示。
此外寡核苷酸在聚丙烯管和玻璃容器中均存在非特異性吸附，這嚴重影響檢測重現性和準確度，因此可以加入表面活性劑來降低或者消除這一影響。在前處理過程中選擇合適的耗材和試劑，例如無RNA/DNA酶的槍頭、離心管和純水等，對于實驗結果也會產生較大的影響。
寡核苷酸屬于酸性強極性化合，在一般色譜柱上很難保留。針對寡核苷酸色譜法主要有離子對反相色譜（IP-RPLC）、離子交換色譜（IEC）、親水作用色譜（HILIC）。其中離子對反相色譜法最為常用，如圖5所示離子對試劑增強寡核苷酸在反相色譜上的保留原理主要基于兩點：首先，帶正電的離子對試劑會與帶負電的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中構成離子對，減少了寡核苷酸的凈電荷并增加了其疏水性，此時疏水相互作用促成了寡核苷酸在離子對反相色譜中的保留；再者，離子對試劑依靠其疏水性烷基鏈可以吸附于反相色譜的固定相上以形成離子交換劑（Ion exchanger），此時靜電相互作用將幫助寡核苷酸在反相色譜中的保留。
離子對試劑的種類繁多，最常用離子對主要為基于乙酸胺試劑和基于六氟異丙醇（HFIP）的胺類離子對試劑。但基于 HFIP的離子對試劑較基于乙酸的離子更為常用，因為與乙酸相比，HFIP的沸點和酸性更弱，這意味著 HFIP 在電噴霧離子化的氣相狀態下更容易揮發，對寡核苷酸的離子化干擾更小，與電噴霧質譜更兼容。常見的離子對試劑主要有三乙胺（TEA）、醋酸三乙胺（TEAA）、碳酸三乙胺（TEAB）、六氟異丙醇（HFIP）。圖6整理一些關于用于反義寡核苷酸的色譜方法參數。
（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）
（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）
寡核苷酸由于其特殊結構，其每個磷酸二酯鍵上都帶有1個酸性質子（PKa~1），這類化合物在ESI源負離子模式下響應較好。由于寡核苷酸含有多個核苷酸基團，在ESI源中發生去質子反應，在負離子模式下形成多重電荷離子，同時很容易結合金屬離子，因此會分散質譜信號。此外隨著寡核苷酸分子量的增加，其檢測響應也會損失嚴重。因此對這類化合物需要優化質譜條件，改善多電荷分布，同時減少待測物在質譜分析加合離子形成。主要通過調節溶液pH值，陽離子濃度和有機溶劑組成來消除或者降低上述因素的影響。在色譜分離中已經提及需要使用到離子對試劑，在一開始方法開發階段，尋找子母離子也必須使用離子對試劑，否則很難找到對應的子母離子碎片，然后基于此條件下再進行質譜參數的優化，可能會獲得比較好的信號響應。
結束語
由于寡核苷酸藥物適應癥涵蓋范圍廣，包括腫瘤、罕見?。∥s性脊髓側索硬化、杜氏肌營養不良、脊髓性肌萎縮）、病毒性疾病、腎臟疾病、心血管疾病、炎癥類疾病、代謝類疾?。ㄌ悄虿。┑?，有望掀起繼小分子化藥、抗體藥物之后又一次新藥研發浪潮。雖然其在生物分析方面存在諸多挑戰，但熙寧生物擁有專業的質譜團隊，能夠為客戶提供各種解決方案，切實解決分析中的各種難題，為新藥研發貢獻一份力量。
Accurant BioTech
熙寧生物是一家專業的符合國際GLP&GCP質量管理規范的大分子生物分析實驗室，為國內外生物醫藥公司提供臨床和臨床前大分子生物分析(Bioanalysis，BA) 和伴隨診斷(Companion Diagnostics，CDx) 產品開發服務。
一站式的生物分析服務包括抗體制備和細胞株構建，樣本采集包及實驗室手冊，符合法規要求的分析方法學的開發和驗證，以及樣本分析。
涵蓋藥代動力學(PK)，藥效動力學(PD)，抗藥抗體(ADA)，中和抗體(NAb)，和生物標志物(Biomarker)檢測。包括基于流式細胞術(FACS)和熒光定量PCR (qPCR) &數字PCR(dPCR)平臺針對細胞治療藥物（如CAR-T，CAR-NK）和基因治療藥物的PK, PD分析服務，以及細胞和基因水平的生物標志物檢測服務。
伴隨診斷產品開發服務包括LDT方法學開發、CDx產品開發及驗證、注冊檢驗、臨床試驗研究和注冊申報。
公司核心技術團隊有10-25年的專業經驗，有多位在國際知名藥企和CRO任職多年的海歸博士、大分子生物分析專家、中美多個行業協會的常任理事，曾參與《中國藥典2015版》“生物樣品分析方法驗證指導原則”、2021年NMPA《藥物免疫原性研究技術指導原則》、及國際上多個行業白皮書的撰寫，支持過200多項全球多中心臨床試驗，100多個各類大分子產品的臨床研究，為多個國際重磅級藥物提供上市審批數據支持，多次成功通過FDA、EMA、OECD、NMPA的審計。
公司在寧波（熙寧生物）、上海（精翰生物）、和美國新澤西(Accurant Bio)都建有實驗室，總面積超過6,500 平方米，科學家團隊規模超過120人。已經和國內外近百家藥企和生物科技公司建立了臨床和臨床前研究的項目合作，涵蓋腫瘤免疫，自身免疫，降糖等多個熱門治療領域，包含蛋白藥物，基因及細胞治療藥物等各類生物大分子，其中雙特異性抗體＞15個，基因和細胞治療藥物＞19個，在研靶點超過40個，臨床試驗超120個。成功支持了國內第一款一類新藥的Car-T產品-藥明巨諾倍諾達®（瑞基奧侖賽注射液）的上市。
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