CRISPR/Cas系統是繼鋅指核酸酶和TALENs技術之后的第三代基因編輯技術，也是目前最為主流的基因編輯系統，因其能夠以高精度，快捷、低成本地進行基因編輯，在生物技術和醫學領域被認為具有重要意義，2015年《科學》將它評為年度十大突破之首。該技術可應用于開發新藥、農產品、轉基因生物等，或作為控制病原體和害蟲的手段，還有潛力治療遺傳性疾病，以及由體細胞突變引起的疾?。ㄈ绨┌Y）。

CRISPR/Cas系統可以說是源于大自然的“基因魔剪”，它是生命進化歷史中，微生物用來抵抗病毒等外源遺傳物質入侵的一種獲得性免疫系統。這與哺乳動物的二次免疫類似，一些細菌在遭受過病毒入侵后，能夠將病毒基因組中的一段序列存儲到自身基因組中一段被稱為“CRISPR”的序列中，當再次遇到病毒入侵時，細菌能夠根據先前存儲的片段識別病毒，并剪切病毒基因而使之失效。

CRISPR意為“成簇規律間隔短回文重復序列”（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），是最初在大腸桿菌、古細菌等原核生物中被發現的DNA序列家族。在基因組中，該序列往往還伴隨著一組同源基因，即Cas基因（CRISPR-associated systems）。Cas基因編碼的Cas蛋白（Cas核酸酶）與CRISPR序列共同發揮作用，因此Cas蛋白與CRISPR序列一起，構成了CRISPR/Cas系統。其中應用最為廣泛的是Cas9蛋白，即CRISPR-Cas9基因編輯技術。

▲CRISPR-Cas9系統作用機制 圖源：Cell

▲Jennifer Doudna 圖源：Marcus Hanschen

在Doudna職業生涯的早期，她致力于推斷RNA分子的三維結構，這讓她對RNA分子的催化活性具有深刻的見解。后來她研究了某些小RNA（small RNAs）對遺傳信息的調控作用，并對CRISPR產生了興趣。2011年，在波多黎各的一次科學會議上，Doudna遇到了當時在瑞典工作的Emmanuelle Charpentier，兩人“一拍即合”，并就解析Cas9蛋白的結構和功能開始了深度合作。2012年，Doudna和Emmanuelle Charpentier共同提出CRISPR-Cas9系統可用于基因組的可編程編輯，這被認為是生物學史上最重要的發現之一。從那時起，Doudna一直是“CRISPR革命”歷程中的領軍人物。

2000年，Jennifer Doudna因利用X射線晶體學技術確定核酶的結構而獲得Alan T. Waterman獎；2015年，Doudna和Charpentier二人因CRISPR-Cas9基因編輯技術獲得生命科學突破獎，同年獲得格魯伯遺傳學獎，并被《時代》周刊評為2015年全球最具影響力100人。此外，Doudna還是臺灣的唐獎（2016）、加拿大蓋爾德納國際獎（2016）、和日本獎（2017）的共同獲得者。美國歷史學家兼記者Walter Isaacson為Jennifer Doudna撰寫了一本傳記：The Code Breaker: Jennifer Doudna, Gene Editing, and the Future of theHuman Race，該書于2021年出版。

Jennifer Doudna不僅是著名科學家，也是一名連續創業者。她與合作者聯合創立了多家生物技術公司以將CRISPR基因編輯技術商業化。

Caribou Biosciences由Doudna等人創立于2011年，是一家處于臨床階段的生物制藥公司，該公司致力于利用CRISPR-Cas9系統，為多種癌癥開發基因組編輯同種異體細胞療法，如CAR-T和CAR-NK細胞療法。

2013年9月，Jennifer Doudna曾與華人科學家張鋒等人共同創立了Editas Medicine，這是一家利用CRISPR基因編輯技術開發罕見病療法的公司，但由于二人的專利糾紛，2014年6月Jennifer Doudna離開了Editas Medicine。在這之后，Emmanuelle Charpentier曾邀請Doudna加入其聯合創辦的CRISPR Therapeutics，該公司基于CRISPR-Cas9技術開發基因編輯治療藥物。不過在Editas經歷了類似“離婚”的體驗后，Jennifer Doudna拒絕了Charpentier的邀請。

2014年，Caribou Biosciences與風險投資公司Atlas Venture聯合成立了一家新的基因編輯公司Intellia Therapeutics，該公司獲得了Caribou Biosciences的專利許可，正在使用模塊化基因組編輯平臺，為遺傳病開發基于CRISPR-Cas9的藥物，并開發新的工程化細胞療法用于癌癥和自身免疫性疾病，Doudna為聯合創始人之一。

Scribe Therapeutics由Jennifer Doudna聯合創立于2018年，是一家分子工程公司，通過開發新型CRISPR技術平臺和遞送技術，克服當前基因組編輯技術的局限性，為那些具有嚴重未滿足醫療需求的疾病開發突破性療法。該公司的新型核酸酶CasX更加緊湊，且可成功應用于基因編輯。

Mammoth的聯合創始人還包括Trevor Martin、Janice Chen和Lucas Harrington。這三位雖然年輕，在創辦該公司時都還不到30歲，但均是行業資深的研究者。他們曾一同入選2018年福布斯醫療健康“30under 30”榜單，也是2020年Business Insider評選的全球30名40歲以下生物醫藥行業青年領軍人物。

CEO Trevor Martin在斯坦福大學獲得計算生物學博士學位時就對診斷學產生了興趣，他最初與Jennifer Doudna通過郵件建立了聯系，表明有意基于Doudna團隊開發的DETECTR技術共同創辦一家公司，Mammoth Biosciences由此誕生；

CTO Janice Chen是Doudna的學生，她正是DETECTR技術的開發者之一（她還是2022年北京冬奧會花樣滑冰男單冠軍陳巍的姐姐）；

CSO Lucas Harrington也是Doudna的學生，是CRISPR-Cas14系統的發現者之一。

DETECTR技術：DETECTR技術基于CRISPR-Cas12a系統，Doudna團隊發現CRISPR-Cas12a系統在剪切靶向的雙鏈DNA的同時，Cas12的DNA酶活性會被激活，而該酶能非特異性切割單鏈DNA（ssDNA）。這為細胞內檢測是否含有特定DNA序列提供了一個全新的思路：同時向細胞內遞送靶向該DNA的CRISPR-Cas12a系統和非特異性ssDNA熒光報告基因（FQ-labeled reporter），一旦檢測到目標DNA，CRISPR-Cas12a系統將被激活，同時熒光報告基因也會被降解，從而釋放出熒光信號?；诖税l現，該團隊開發了一種可用于診斷病毒感染的新型診斷工具，并通過與等溫核酸擴增技術的聯用提高了靈敏度，最終命名為“DETECTR”（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）。

CRISPR-Cas14系統：Doudna團隊發現的Cas14序列家族編碼的Cas14蛋白大小僅為40-70kDa，Cas14能夠結合并剪切單鏈DNA上的目標序列，與Cas9不同，Cas14不需要依賴PAM序列，除了這種順式切割，Cas14還能夠不加選擇地反式切割單鏈DNA，類似于Cas13和Cas12。他們還發現Cas14在識別單鏈DNA方面比Cas13或Cas12更具特異性。

根據官方信息，目前Mammoth的工作分為4個方面：基于CRISPR的SARS-CoV-2檢測解決方案、基于CRISPR的分子診斷平臺、基于CRISPR的精準基因編輯療法開發、探索新的CRISPR-Cas系統。

Mammoth最新開發的DETECTR BOOST^®平臺是一個基于CRISPR的一站式分子診斷系統，可實現高通量、從樣本到結果的一站式檢測，其性能與PCR等效，并可大幅縮短操作時間。2022年1月，其DETECTR BOOST^® SARS-CoV-2試劑盒獲美國FDA授予的緊急使用授權（EUA），目前已授權與安捷倫Bravo BenchCel DB自動化液體處理平臺結合，用于檢測疑似COVID-19個體的鼻咽或口咽拭子樣本中的SARS-CoV-2RNA，這是首個將CRISPR技術與實驗室自動化SARS-CoV-2檢測相結合的高通量解決方案。利用該診斷系統可在每8小時輪班內完成1500次檢測，且只需要一小時的人工操作。

值得一提的是，在需求激增、耗材短缺的背景下，Mammoth團隊努力將試劑盒設計得精簡高效，并與默克公司進一步優化產品配方，該試劑盒已簽約由默克負責制造。

不過在診斷領域，Jennifer Doudna和張鋒又一次“狹路相逢”，張鋒團隊曾利用CRISPR-Cas13系統開發了名為“SHERLOCK”的病毒檢測系統，并于2019年聯合創立了Sherlock Biosciences，其Sherlock™ CRISPR SARS-CoV-2試劑盒也已獲得美國FDA的緊急使用授權，這是FDA首次批準基于CRISPR基因編輯技術的新冠病毒檢測產品，也是首次授權使用CRISPR技術進行傳染病檢測。Cas13系統是由張鋒和Eugene Koonin使用計算生物學方法發現的，后由Jennifer Doudna在加州大學伯克利分校的團隊進一步表征。

Mammoth的分子診斷平臺也是基于DETECTR^®技術，可應用于單核苷酸多態性（SNP）檢測、細菌感染檢測、癌癥篩查和分析、抗生素耐藥性檢測、病毒感染檢測。該技術可搜索樣本中是否存在指定疾病的特定核酸，提供可操作的臨床信息。該檢測系統利用經編程的CRISPR核酸酶捕獲到特定的基因序列，找到目標序列后，核酸酶的剪切能力會被激活，從而產生信號，出現該信號意味著已檢測出目標序列。

Mammoth在創立之時，其目標就是創建一種即時診斷工具，可以檢測多種疾病，可供醫院和家中使用，并且具有可支付性?，F在該公司的DETECTR^®平臺可以通過擴展檢測項目集成到不同的產品中，簡單、快速、可編程。

Mammoth正在利用其蛋白質發現平臺中的新型CRISPR-Cas酶來實現精準的基因編輯以治療疾病。該公司的超小型Cas14和CasΦ核酸酶家族克服了Cas9對病毒和非病毒遞送方法的限制，并改變了對PAM序列的要求，有望成為治療用基因編輯系統的候選者。潛在治療領域有免疫腫瘤學、自身免疫性疾病、肝靶向疾病、血液病、眼科、神經病學、神經肌肉疾病、心血管疾病等。

下圖左比較了Cas14a和CasΦ-2核酸酶和較常用的Cas9和Cas12核酸酶結構域（RuvC和HNH），蛋白質長度按比例繪制；下圖右比較了Cas14a-c和CasΦ系統和Cas12a-e和Cas9系統的長度分布：

Mammoth正在利用其專有的蛋白質發現平臺來識別新的Cas蛋白以應對當前CRISPR-Cas系統面臨的挑戰，擴大CRISPR-Cas技術應用范圍。該公司的蛋白質發現平臺包含獨家宏基因組數據庫和機器學習算法，以搜尋新的CRISPR-Cas系統。新的CRISPR-Cas系統可以有效避免專利糾紛

該發現過程分為4個步驟：

1. 從環境樣本中獲取微生物DNA進行測序；

2. 將“宏基因組”序列在數據庫中進行編譯；

3. 利用算法在數據庫中檢索識別CRISPR系統的序列；

4. 在實驗室對CRISPR系統進行合成和檢測。

新發現的Cas蛋白創建了一個多樣化的工具包，實現新的應用。目前，Mammoth已經識別出了新的Cas蛋白家族，包括Cas12、Cas13，以及超小型的Cas14、CasΦ。這些Cas蛋白具有更好的熱穩定性、更快的反應動力學、可替代的PAM序列，提供了更靈活的靶向性，且蛋白質尺寸更小，從而開辟了新的細胞遞送選擇。該公司可以利用這些特性進行更快、更靈敏的分子診斷檢測，并為細胞和基因治療提供有效的DNA嵌入片段。

▲藥融云數據庫

下圖為Mammoth Biosciences主要投資方：

在治療領域：2022年1月，拜耳與Mammoth Biosciences官宣合作，旨在利用Mammoth的CRISPR系統共同開發體內基因編輯療法。根據協議條款，Mammoth公司將獲得4000萬美元的首付款，并有資格獲得目標期權行權費用以及超過10億美元的未來潛在里程碑付款。協議涉及5個預先選擇的適應癥，其中首先關注肝臟靶向疾病。此外，拜耳將支付研究經費以及分層特許權使用費，最高可達凈銷售額的兩位數百分比。兩家公司還正在非排他性基礎上探索體外項目相關工作；

2021年10月，Vertex Pharmaceuticals和Mammoth Biosciences宣布達成一項新合作，旨在利用Mammoth的超小型CRISPR系統共同開發治療兩種遺傳疾病的體內基因編輯療法。根據協議條款，Mammoth將獲得4100萬美元的預付款，并可能獲得高達6.5億美元的里程碑付款，以及產品凈銷售額的分級特許權使用費；

Mammoth Biosciences還分別在2019年12月和2020年1月與Horizon Discovery達成合作，將Mammoth在CRISPR方面的知識產權與Horizon在中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）方面的專業知識相結合。根據協議，雙方將共同識別并優化新型Cas蛋白，以開發新一代基因工程CHO細胞，用于生產治療性抗體等生物藥。

在診斷領域：2021年1月，安捷倫科技與Mammoth Biosciences宣布達成一項聯合營銷協議，以支持推出的基于CRISPR的完整SARS-CoV-2診斷解決方案。該解決方案包括安捷倫的Bravo自動化工作站和Mammoth Biosciences的DETECTR BOOST^®檢測平臺；

2020年10月，Mammoth Biosciences宣布與默克旗下Millipore Sigma達成協議，將Mammoth的DETECTR BOOST^®SARS-CoV-2試劑盒由Millipore Sigma代工生產。同時Mammoth還與Hamilton公司達成合作，將基于CRISPR的高通量SARS CoV-2檢測進行商業化；

2020年7月，Mammoth Biosciences獲得美國國立衛生研究院（NIH）的加速診斷RADx項目支持，幫助擴展其高通量CRISPR SARS-CoV-2診斷平臺，以解決檢測能力短缺問題。Mammoth的平臺是該計劃資助的第一個基于CRISPR技術的項目；

2020年5月，Mammoth Biosciences與GSK Consumer Healthcare建立合作，使用基于CRISPR的DETECTR平臺開發COVID-19檢測產品。

參考：

NMPA/CDE；

藥融云數據：www.pharnexcloud.com；

FDA/EMA/PMDA；

相關公司公開披露；

The Heroesof CRISPR,DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.12.041；

Jinek M,Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity. Science. 2012;337(6096):816-821.doi:10.1126/science.1225829；

Crackingthe Code: Jennifer Doudna and Her Amazing Molecular Scissors,https://alumni.berkeley.edu/california-magazine/winter-2014-gender-assumptions/cracking-code-jennifer-doudna-and-her-amazing；

Marino M.Biography of Jennifer A. Doudna. Proc Natl Acad Sci U S A.2004;101(49):16987-16989. doi:10.1073/pnas.0408147101；

https://mammoth.bio/；

ForbesChina；等等