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您現在的位置：攻克生物分析在以AAV為載體基因治療藥物中應用的難點
基因治療
基因治療的概念是在20世紀70年代初提出來的，最初的概念是引入一個正常的基因來取代一個突變基因，雖然現在有更多的替代方法，如基因編輯和堿基編輯，但它仍然是我們高度依賴的主要策略之一。
基因治療按照基因導入后的細胞培養模式可以分為“離體治療”和“體內治療”。“離體治療”的操作對象是從病人身上分離的細胞，然后在體外經過改造和擴增再回輸到體內達到治療的效果，例如CAR-T治療等。“體內治療”操作時只需要把攜帶目的基因的病毒載體注入病變部位即可，理論上可以實現任意種類細胞的基因改造，不再像“離體治療”那樣受到細胞種類的限制，這是“體內治療”相對“離體治療”最大的優勢，但在技術上真正實現任意細胞的基因改造目前還有一定難度，例如AAV病毒載體基因治療。此外，“體內治療”也省去了“離體治療”的細胞收集、基因改造、培養擴增等繁瑣的操作。
以AAV為載體的基因治療藥物在產品CMC階段、臨床前和臨床階段都會用到各種各樣的生物分析手段。不同技術平臺對AAV為載體的基因治療藥物提供了不同解決方案。
我們利用Naica數字PCR技術對重組腺相關病毒(rAAV)質粒載體和病毒基因組中ITR（CY5標記）、目的基因（GOI，HEX標記）和轉錄相關調控元件WPRE（FAM標記）三個不同基因位點同時拷貝數定量的方法進行優化，在數據分析中對不同病毒樣品的前處理方案的條件進行闡述和比較，發現病毒樣品的前處理方案中ITR發卡結構的線性化和衣殼蛋白的裂解條件對病毒基因組拷貝數定量的精確性影響尤為重要，為數字PCR方法在基因治療病毒載體的質量控制體系中建立標準的檢測方法提供依據。
Fig1、cdPCR檢測WPRE/GOI/ITR 三靶標1D散點圖
A圖顯示WPRE檢測的1D散點圖，B圖顯示GOI檢測的1D散點圖，C圖顯示Msp I酶切處理前ITR檢測的1D散點圖，D圖顯示Msp I酶切處理后ITR檢測的1D散點圖，藍色表示WPRE陽性微滴群，綠色表示EGFP陽性微滴群，紅色表示ITR陽性微滴群，灰色表示陰性微滴群。當WPRE或GOI比ITR越接近1：2，則產品的基因組更完整。
難點分析2
難點分析2：AAV基因治療在臨床前的組織分布和臨床階段的脫落研究?；谒幬镞M入體內后會進入各器官，根據作用機理和治療目的，在臨床前研究組織分布，可以預測藥物安全性，并指導臨床方案。臨床階段的脫落分析將通過對患者給藥后的排泄物進行測定。通常會包括熒光定量PCR反應和傳染性試驗開展。
我們具有多款基因治療藥物，包括溶瘤病毒和不同血清型AAV基因治療藥物的臨床前組織分布和臨床階段脫落研究經驗。使用熒光定量PCR開展這兩項檢測時，需要合成特異性強和靈敏度高的引物和探針。多種組織樣品和代謝物樣品的DNA提取過程中可能會引物一些PCR抑制物，抽提過程中產物量的差異性都需考量。
Fig2、精翰生物在PK/脫落研究中的流程圖
難點分析3
難點分析3：AAV基因治療在免疫原性方面不僅需要考慮體液免疫，還需要考慮細胞免疫。體液免疫檢測內容可以為：抗衣殼蛋白抗體、抗衣殼蛋白中和抗體和抗表達產物抗體。使用的分析方法通常為LBA或者cell based assay。細胞免疫檢測內容可以為：針對衣殼蛋白T細胞應答或針對表達產物抗體T細胞應答。無論是體液免疫還是細胞免疫，精翰生物擁有不同策略所開發的方法學和檢測設備。
我們使用ELISPOT平臺，已經開發和驗證了基于ELISPOT技術檢測人PBMC經CEF刺激后分泌IFN-γ的免疫細胞數的方法學。同時，也已經開展了不同血清型AAV刺激PBMC后分泌INF-γ的免疫細胞數的方法學。
Fig3、精翰生物在ELISPOT細胞免疫上的應用
1.選擇合適的刺激物和免疫細胞（PBMC, B細胞, T細胞）作用加入ELISPOT板中。
2. 培養孵育一段時間，使激活的免疫細胞分泌細胞因子。
3. ELISPOT板已包被抗細胞因子的抗體，可以捕獲在激活的免疫細胞周圍分泌細胞因子。
4.洗板去除細胞，加入二抗反應，酶聯顯色，激活的免疫細胞會形成較為規則的圓形斑點。
實驗室
精翰生物擁有不同檢測平臺和技術手段，2022年中，熙寧I精翰搭建起了二代測序平臺。精翰生物擁有設計合理、設施完備的獨立的高通量測序實驗室。實驗室設計遵循高通量測序的具體檢測流程和防治污染的原理。實驗包括一個專用走廊，分區設計依次為試劑準備間、標本制備區、擴增一區、雜交捕獲區/擴增二區、測序間和電泳間。
實驗室設備齊全且經過合理驗證，目前實驗室儀器有TC-96/G/H(b)B（基因擴增儀）、QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument （QuantStudioTM 5實時定量PCR儀）、Agilent 4150（片段分析儀）、Covaris M220（核酸打斷儀）、E-Gel Power Snap（凝膠電泳系統）、Qubit（熒光計）、NanoPhotometer N60 Touch（超微量分光光度計）等，全面滿足高通量測序實驗需求。也為AAV基因治療藥物在CMC、臨床前和臨床階段提供了更完善的服務需求。
Accurant BioTech
熙寧生物
熙寧生物是一家專業的符合國際GLP&GCP質量管理規范的大分子生物分析實驗室，為國內外生物醫藥公司提供臨床和臨床前大分子生物分析(Bioanalysis，BA) 和伴隨診斷(Companion Diagnostics，CDx) 產品開發服務。
一站式的生物分析服務包括抗體制備和細胞株構建，樣本采集包及實驗室手冊，符合法規要求的分析方法學的開發和驗證，以及樣本分析。
涵蓋藥代動力學(PK)，藥效動力學(PD)，抗藥抗體(ADA)，中和抗體(NAb)，和生物標志物(Biomarker)檢測。包括基于流式細胞術(FACS)和熒光定量PCR (qPCR) &數字PCR(dPCR)平臺針對細胞治療藥物（如CAR-T，CAR-NK）和基因治療藥物的PK, PD分析服務，以及細胞和基因水平的生物標志物檢測服務。
伴隨診斷產品開發服務包括LDT方法學開發、CDx產品開發及驗證、注冊檢驗、臨床試驗研究和注冊申報。
公司核心技術團隊有10-25年的專業經驗，有多位在國際知名藥企和CRO任職多年的海歸博士、大分子生物分析專家、中美多個行業協會的常任理事，曾參與《中國藥典2015版》“生物樣品分析方法驗證指導原則”、2021年NMPA《藥物免疫原性研究技術指導原則》、及國際上多個行業白皮書的撰寫，支持過200多項全球多中心臨床試驗，100多個各類大分子產品的臨床研究，為多個國際重磅級藥物提供上市審批數據支持，多次成功通過FDA、EMA、OECD、NMPA的審計。
公司在寧波（熙寧生物）、上海（精翰生物）、和美國新澤西(Accurant Bio)都建有實驗室，總面積超過6,500 平方米，科學家團隊規模超過150人。已經和國內外近百家藥企和生物科技公司建立了臨床和臨床前研究的項目合作，涵蓋腫瘤免疫，自身免疫，降糖等多個熱門治療領域，包含蛋白藥物，基因及細胞治療藥物等各類生物大分子，其中雙特異性抗體＞15個，基因和細胞治療藥物＞28個，在研靶點>40個，臨床試驗>180個。成功支持了國內第一款一類新藥的Car-T產品-藥明巨諾倍諾達®（瑞基奧侖賽注射液）的上市。
公司地址：
上海：上海市外高橋自由貿易試驗區加楓路8號5樓、7樓
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