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雙特異性抗體通過結合兩個抗原靶點，實現一加一大于二的療效。但由于其復雜的作用機制、不同的結構變化和雙靶點結合，開發生物測定方法和其他類型的分析方法來表征雙特異性抗體是具有挑戰性的。本文梳理開發生物學測定方法，需要重點考量的三個因素。
生物測定方法開發
與藥物開發階段相適應
分階段開發和實施生物測定的方法是行業和監管機構廣泛接受的策略，類似的原則也適用于雙特異性抗體藥物開發。
產品開發的早期階段，通常使用的方法是結合實驗（Binding Assay）,其中最常用的包括酶聯免疫吸附實驗(ELISAs)或表面等離子體共振(SPR)技術。
產品開發的后期階段，通常使用可以反映雙特異性抗體作用機制（Mechanisms of Action, MoA），更為復雜的方法，上市申請遞交之前進行驗證。但是一般建議更早開發基于MoA的相關生物測定方法，這樣可更大程度了解工藝和產品，而且可在關鍵臨床試驗之前更好地了解該方法的性能。
臨床階段，需要使用基于細胞的生物測定方法，監測關鍵步驟和成分的生物學效應。
生物測定方法的開發是基于表征MoA的需要。如果MoA只需要與靶點結合，一種替代方法，如蛋白質結合或競爭性結合試驗，可能足以確定效力。而開發可靠的和QC適用的，開發基于細胞的生物測定方法比基于非細胞的結合分析方法更具挑戰性。
生物測定方法開發
與藥物作用機制相符合
生物測定的設計策略是由藥物預期的MoA決定的，一種設計良好的生物測定方法不僅準確可重現，而且能夠充分反映藥物的作用機制。
在雙特異性抗體開發過程，可能涉及開發雙重、三重協同MoAs的生物測定方法。在某些情況下，一個分子中存在多種作用機制，優先使用單一分析模型來測量所有MoAs的方法用于產品放行和穩定性測試。如果需要，可以開發多種活性表征分析方法，例如：細胞殺傷，細胞因子分泌，ADCC，ADCP等來充分的評估分子的生物活性。
1 細胞橋接（Cell-bridging BsAbs）
最常見的是T細胞雙抗，包括一個anti-CD3抗體臂和一個anti-TAA抗體臂。T細胞雙抗橋接靶細胞和T細胞，形成免疫突觸，誘導T細胞激活，釋放穿孔素，顆粒酶B等裂解靶細胞。
相關生物測定方法
1.結合實驗：任何基于抗體技術的藥物，結合實驗都是基礎。通常使用ELISA法和SPR法。
2.生物活性測定：T細胞雙抗是效應細胞和靶細胞形成免疫突觸，進而活化，殺傷靶細胞。優化的報告基因法檢測效應細胞激活，以及細胞殺傷實驗檢測靶細胞的殺傷效果，是常用的生物活性測定實驗。
3.其他功能測定：通過流式細胞術檢測細胞因子、顆粒酶、穿孔素等。
2 配體-受體結合
（Receptor/Ligand BsAbs）
這類雙抗靶向多個受體，激活受體（如現在流行的雙激動抗體）或者阻斷受體功能（如雙免疫檢查點抗體）。
PD-1XCTLA4雙抗是目前國內最擁擠的雙抗管線（如康方生物AK104），通過阻斷PD-1/PD-L1，CTLA-4/CD80的結合，從而恢復T細胞功能。
生物測定方法
1.結合實驗：使用ELISA和SPR法進行單靶點和雙靶點的結合實驗。
2.生物活性：受體激活或阻斷后的細胞活性變化，如增殖，凋亡，細胞因子釋放等。
3.其他功能研究：如激活或阻斷受體后，下游激酶活性改變，鈣流變化等
4.效應功能：CDC、ADCC、ADCP、FcγR結合等
3 輔助因子模擬
（Cofactor Mimicking BsAbs）
羅氏的Emicizumab (Hemlibra®)，是一種用于治療A型血友病的雙特異性抗體，與凝血因子X和IX結合，因此能夠發揮凝血因子XIII的作用。
生物測定方法
1.結合實驗：使用ELISA和SPR法進行單靶點和雙靶點的結合實驗
2.生物活性：FXa活性
3.其他功能研究：凝血酶生成分析
4 歸巢雙抗
歸巢雙抗的一個抗體臂負責將分子帶到特定的、通常難以到達位置（如跨越血腦屏障），另外一個抗體臂作用于治療靶點。
生物測定方法
1.結合實驗：BLI及競爭法ELISA。
2生物活性：歸巢抗體之外分子的生物活性。
3.其他功能研究：熒光示蹤檢測雙特異性抗體在體內和細胞內分布等 。
整體雙特異性抗體表征策略
BsAbs的有效性和安全性評估依賴于系統的表征和生物測定方法開發，可反映這些雙靶向抗體的生物活性，并區分更高階的結構、效價和療效，包括整體穩定性、片段/聚集、免疫原性、抗原特異性、親和力、生物活性等。
生物分析方法還可以進行免疫原性和PK/PD評估，以確定雙特異性抗體的的安全性和有效性。免疫原性是宿主對治療性雙特異性抗體不必要的免疫反應，會清除抗體，改變PK，降低治療效果等。免疫原性通過檢測抗藥物抗體進行臨床評估，包括IgM、IgG、IgE和/或IgA等。
用于評估免疫原性的生物測定包括結合免疫測定，如ELISA檢測所有能夠結合治療性雙特異性抗體的ADA，以及針對生物活性位點的中和分析（體外細胞分析或競爭性配體結合分析），MHC-II相關肽蛋白質組學(MAPPs)檢測可以表征抗體免疫原性片段。生物制劑的PK至少部分地由FcRn介導的再循環決定。體外通過SPR等監測雙特異性抗體Fc與FcRn的結合能力，評估對PK的潛在影響。
小結
雙特異性抗體作用機制復雜，通過系列完整的生物測定方法，表征雙特異性抗體藥物關鍵質量屬性，生物學活性等，以確保在臨床階段，雙特異性抗體能夠充分發揮其MoA的活性，起到治療效果。生物測定采用的方法與藥物開發階段相關，其中MoA相關生物活性測定是重中之重，也是開發難點，因而應該從雙抗項目開發最初階段，同步建立對應的生物測定方法，才能保證雙抗項目的穩步推進。選擇有相關項目經驗的CDMO企業，可以保證雙抗工藝開發和生物測定方法開發的同步性和一致性，加速項目進展。
康日百奧分析實驗室擁有Thermo Orbitrap Exactive HF-X液質聯用儀，Thermo Vanquish UHPLC, Protein Simple Maurice, SCIEX PA800 plus, Waters ACQUITY H Class UPLC, Thermo CAD檢測器, Malvern全自動毛細管差示掃描量熱儀，Octet分子間相互作用儀，MD M5酶標儀，Roche480 qPCR儀等先進研究和檢測設備，可對單克隆抗體，雙抗，融合蛋白，ADC等生物藥進行分析方法開發、確認和驗證，并提供全面的蛋白表征研究（包含工藝可比性研究，生物類似藥的相似性評價等）。
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參考文獻
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康日百奧生物科技（蘇州）有限公司是一家專業的生物藥CDMO。公司服務范圍包括細胞株開發、原液和制劑工藝開發、分析方法開發，制劑處方開發以及原液和成品的cGMP生產。團隊成員均為經驗豐富的生物制藥行業資深人士，對生物藥CMC領域有著深刻的理解。他們在業界領先的生物制藥研發和生產企業所積累的豐富經驗是康日百奧得以快速建立并為客戶提供優質服務的關鍵。已成功幫助多個合作伙伴項目獲得中國，美國，澳大利亞，歐洲等的臨床批件。
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