藥融圈社群
您現在的位置：Ex Vivo試驗用于藥效評估案例分享和難點分析
前 言
隨著國家藥品監督管理局藥品審評中心正式發布《以臨床價值為導向的抗腫瘤藥物臨床研發指導原則》，中國的新藥研發邁入深水區。當以患者為核心的臨床藥物研發開展新藥臨床試驗設計時，對照組由普遍安慰劑變成了廣泛應用的最佳治療方式/藥物，創新藥臨床研發和獲批的規則正在被深刻的改變，同時新藥物獲批難度將會進一步增大。臨床試驗階段，新藥是否有效？將會被新藥是否比現有療法/同類藥物更加有效這個問題所替代。臨床試驗檢測過程中越早對有效性的問題進行回答，在現有的政策環境下越能夠加快臨床的進度，或者及時規避風險。使用Ex Vivo試驗用于早期臨床特別是一期臨床的藥效學評估，是新藥特別是First in class新藥常用的評估方式。筆者將從檢測原理，案例分析和熙寧生物的臨床檢測實踐三方面對Ex Vivo試驗用于早期臨床的藥效學評估進行論述。
Ex Vivo試驗用于臨床檢測原理
有別于In-Vitro（體外試驗）使用的活性蛋白或者腫瘤細胞系，In-Vivo（體內試驗）使用動物或者人體，Ex Vivo（離體試驗）使用的從動物/人體取出的原代細胞/組織，采用體外試驗的模式進行檢測分析。
臨床Ex Vivo試驗模式由于其使用的材料來自于用藥后的人體，該檢測方法相對于In-Vitro試驗來說，能夠較為真實的還原藥物在人體復雜免疫細胞互作環境下的真實表現，更具備生理相關性。同時，臨床Ex Vivo試驗使用體外檢測的模式，相對于In-Vivo試驗，試驗周期較短，能夠更為快捷得到有參考價值的數據，特別是在臨床一期健康受試者的臨床試驗中，基于藥物的作用機理，通過設計合適的Ex Vivo評價方案，可以獲得跟藥物作用機理緊密相關的藥效學數據。
臨床Ex Vivo試驗多采用能夠通過較為簡單方式從人體獲得的生物材料，通常為人全血，人PBMC或者人血清。使用人體的生物材料進行檢測，樣品具備多重屬性，既包含有藥物成分，也作為檢測體系中重要構成材料，且存在個體差異，不同采樣點的狀態差異等，臨床Ex Vivo試驗的樣品采集條件控制，檢測條件控制，數據處理和解讀均較為復雜，是難度和變異系數最高的檢測實驗類型。
無論是小分子藥物，抗體類藥物，免疫調節劑類藥物，疫苗類藥物均可通過使用人全血中特定的細胞亞群或者組分，直接進行或者作為替代標志物進行藥效學評估。
Ex Vivo試驗臨床早期進行
藥效學檢測案例分析
隨著中國新藥研發進一步加速，藥物研發模式完成了由藥物仿制到靶點追蹤模式的轉變，隨著監管政策的進一步收緊，藥物研發模式必將進一步進行優化。筆者認為后續新藥研發模式進一步優化，其中一個重要環節在于臨床藥物評價體系的構建，使用Ex Vivo試驗臨床早期進行藥效學檢測評估將會使臨床藥物評價體系中重要一環，下面筆者通過公開的資料梳理下Ex Vivo試驗用于早期藥效學評估的案例。
案例1：抗體藥物Zolbetuximab（anti-Claudin18.2）和cetuximab (anti-EGFR)的Ex Vivo ADCC和CDC功能。
抗體藥物通過靶向腫瘤的靶點，介導機體免疫細胞和補體殺傷腫瘤細胞，發揮ADCC和CDC功能是靶向抗體藥物的主要的藥效學作用機理，在1期臨床中進行Ex Vivo ADCC和CDC功能學評估是預測在個體中藥物是否能夠起效的一個關鍵指標。使用細胞殺傷模型檢測人樣品中IMAB362藥物介導人樣品PBMC介導的殺傷NUGC4的效果，報告基因方法進行檢測。
案例2：CD28免疫激動劑Davoceticept (ALPN-202)的Ex Vivo臨床藥效學評估
使用全血共刺激模型檢測人樣品中CD28激動劑Davoceticept藥物介導全血刺激后IL2的分泌，ELISA方法進行檢測。
案例3：C3補體抑制劑Empaveli的Ex Vivo臨床藥效學評估
使用補體旁路活化途徑溶血模型檢測人樣品中Empaveli藥物介導的人樣品中血清的溶血效果。
案例4：CDK4/6抑制劑Trilaciclib的Ex Vivo臨床藥效學評估
使用全血刺激模型檢測人樣品中Trilaciclib介導的對人樣品中全血T細胞的增殖抑制效果,流式方法進行檢測。
案例5：RSV抗體Nirsevimab的Ex Vivo臨床藥效學評估
案例6：COVID-19 vaccine BNT162b1的Ex Vivo臨床藥效學評估
使用COVID-19 Spike蛋白刺激PBMC模型檢測Spike蛋白RBD多肽Pool刺激人樣品中CD4+和CD8+ T細胞，檢測人樣品細胞免疫效果，ELISPOT方法進行檢測。
案例7：IL-4Ra 抑制劑 AZD1402的Ex Vivo臨床藥效學評估
使用全血刺激模型檢測人樣品中AZD1402介導的對人樣品中全血CD3細胞的STAT6磷酸化水平抑制效果，流式方法進行檢測。
熙寧生物
Ex Vivo試驗臨床檢測實踐和難點考量
熙寧生物有非常豐富的小分子藥物和生物制品早期臨床的藥效學評估經驗，相對于傳統的PK藥物代謝，定量型biomarker或者免疫原性分析方法，Ex Vivo藥效學試驗有包含全部或者部分顯著性區別和難點：
1. 非定量型檢測。藥效學檢測的是藥物引起體內生物材料的變化如PBMC的轉錄因子蛋白磷酸化水平變化，該變化指向的目的分子往往沒有標準物質，無法在檢測體系中建立標準曲線，樣品檢測無法匯報具體的濃度結果。該情況引發的后果是需要通過檢測方法得到信號值變化或者均一化以后的信號值變化來對藥物引起的變化進行表征，而在長期的樣品分析過程中，信號值變化除了會受到藥物的影響，同時也會受到不同天檢測方法條件的影響，為多變量參數。因此，在進行Ex Vivo藥效學試驗時，維持不同天檢測方法條件的嚴格一致性，是臨床藥效學試驗取得跟藥物有相關性結果的關鍵。
2. 個體差異。Ex Vivo藥效學試驗檢測結果除了受藥物影響外，會受到來自于個體的生物材料的顯著影響，通常生物材料具備顯著的個體差異（如不同個體的PBMC在檢測體系中有不同的響應強度）。該情況引發的后果是需要通過檢測單個個體的Pre-dose樣品和用藥后樣品進行藥效學比較，可能會出現不同個體的藥效學結果差異較大的情況，如在A個體中藥物有效，在B個體中藥物無效。個體用藥后的藥效需要結合個體能夠引發的檢測體系的響應強度綜合進行判斷，必要時需要根據個體能夠引發的檢測體系的響應強度進行分組來分析藥物的藥效學效果。
3.樣品穩定性。Ex Vivo藥效學試驗的檢測樣品具備多元屬性，樣品中的藥物為檢測物質，樣品中的生物材料如全血為檢測體系的試劑。通常情況下藥物較為穩定，但是作為檢測試劑的生物材料并非穩定的存在，全血在檢測體系的穩定性通常為48-72小時以內，個別項目要求24小時以內， 甚至為8小時以內，需要進行嚴格的考察。樣品的檢測結果由樣品的藥物濃度和樣品的生物材料活性共同決定，在進行樣品分析時需要確保樣品的生物材料活性出于最佳的狀態，這對樣品采集，運輸和檢測時間均有較為嚴格的要求。同時由于樣品需要較短時間內進行分析，會導致Pre-dose，用藥后各采血點的樣品不能同時在一個分析批進行分析，沒有標準曲線的對分析批信號的校準，將會進一步增加檢測結果的波動性。
4. 樣品刺激體系的建立。通常情況下健康人用藥后，樣品中的藥物對樣品中的生物材料無明顯的藥效學作用，需要對樣品中的生物材料進行刺激后，樣品中的藥物才能顯現出藥效學。刺激物的選擇，刺激時間的選擇，檢測目的分子和檢測平臺的選擇均需要基于藥物的作用機理，生物材料的生理學效應進行設計，一個類型的藥物需要一個類型的方法。在進行Ex Vivo藥效學試驗時樣品中生物材料的運輸保存和刺激，將會顯著性的影響檢測結果，是整個分析方法組成的一部分。在進行方法學開發和驗證過程中，將藥物加入生物材料中配制為模擬樣品進行方法學驗證，是一個方法是否符合實際應用的關鍵。
5. 平臺和人員熟練度。Ex Vivo藥效學試驗時通常包括樣品的刺激和目的檢測分子檢測兩部分，樣品的刺激通常需要進行全血，PBMC等生物材料的處理，由于該類型生物材料的個體差異和穩定性較差，需要有較為豐富經驗的人員。同時不同的藥效學方法檢測平臺不一樣，可能會使用如細胞，ELISA，FACS，MSD，ELISPOT等試驗技能，一個完整的Ex Vivo藥效學試驗需要試驗人員兩方面能力均要有熟練度的要求，對人員和平臺的復合能力要求較高。
6. 方法學驗證和數據匯報體系設計。Ex Vivo藥效學試驗無明確的指導原則，由于其非定量試驗類型，不能完全按照PK方法的參數進行驗證，由于其存在個體差異，也不能完全按照免疫原性的參數進行驗證，如何設計一個合適的方法學驗證體系來證明或者表征方法的精密度，靈敏性，特異性，穩固性，穩定性，基質效應等參數，確保能夠滿足真實樣品的檢測需求，需要基于多方面的考量。
綜上所述，Ex Vivo藥效學分析方法是難度非常大的分析方法，從方法的設計，方法學開發和方法學驗證，對人員和平臺均需要有較高的熟練度和經驗需求，需要有專業化團隊進行完成。
基于藥物作用機理的了解和廣泛的文獻資料的檢索調研，熙寧生物專業化的Ex Vivo藥效學評估團隊能夠為客戶的早期臨床藥物提供個性化的臨床藥效學評估解決方案，加速臨床研發進度，助力臨床藥物研發的精細化管理，歡迎咨詢討論。
Accurant BioTech
熙寧生物
熙寧生物是一家專業的符合國際GLP&GCP質量管理規范的大分子生物分析實驗室，為國內外生物醫藥公司提供臨床和臨床前大分子生物分析(Bioanalysis，BA) 和伴隨診斷(Companion Diagnostics，CDx) 產品開發服務。
一站式的生物分析服務包括抗體制備和細胞株構建，樣本采集包及實驗室手冊，符合法規要求的分析方法學的開發和驗證，以及樣本分析。
涵蓋藥代動力學(PK)，藥效動力學(PD)，抗藥抗體(ADA)，中和抗體(NAb)，和生物標志物(Biomarker)檢測。包括基于流式細胞術(FACS)和熒光定量PCR (qPCR) &數字PCR(dPCR)平臺針對細胞治療藥物（如CAR-T，CAR-NK）和基因治療藥物的PK, PD分析服務，以及細胞和基因水平的生物標志物檢測服務。
伴隨診斷產品開發服務包括LDT方法學開發、CDx產品開發及驗證、注冊檢驗、臨床試驗研究和注冊申報。
公司核心技術團隊有10-25年的專業經驗，有多位在國際知名藥企和CRO任職多年的海歸博士、大分子生物分析專家、中美多個行業協會的常任理事，曾參與《中國藥典2015版》“生物樣品分析方法驗證指導原則”、2021年NMPA《藥物免疫原性研究技術指導原則》、及國際上多個行業白皮書的撰寫，支持過200多項全球多中心臨床試驗，100多個各類大分子產品的臨床研究，為多個國際重磅級藥物提供上市審批數據支持，多次成功通過FDA、EMA、OECD、NMPA的審計。
公司在寧波（熙寧生物）、上海（精翰生物）、和美國新澤西(Accurant Bio)都建有實驗室，總面積超過6,500 平方米，科學家團隊規模超過150人。已經和國內外近百家藥企和生物科技公司建立了臨床和臨床前研究的項目合作，涵蓋腫瘤免疫，自身免疫，降糖等多個熱門治療領域，包含蛋白藥物，基因及細胞治療藥物等各類生物大分子，其中雙特異性抗體＞15個，基因和細胞治療藥物＞28個，在研靶點>40個，臨床試驗>180個。成功支持了國內第一款一類新藥的Car-T產品-藥明巨諾倍諾達®（瑞基奧侖賽注射液）的上市。
公司地址：
上海：上海市外高橋自由貿易試驗區加楓路8號5樓、7樓
寧波：寧波市高新區聚賢路587弄A5幢4樓、8樓
美國：259 Prospect Plain Road, Building H, Suite168, Cranbury, New Jersey, USA
網址：www.accurantbio.com
公司郵箱：customer-services@accurantbio.com
聯系方式：0574-87878487
- END -
下一篇：阿茲夫定：中國審評報告出爐！
