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抗體藥物生物活性檢測的基礎是抗體藥物生物活性的發生機制。比如CD20抗體（如利妥昔單抗）與表達細胞表面CD20結合，通過ADCC等效應，殺傷靶細胞。而PD-1單抗（如Keytruda）通過阻斷PD-1和PD-L1的結合，恢復耗竭的T細胞的效應活性，殺傷腫瘤細胞。因為不同抗體藥物發揮效應的機制不同，需要建立不同的生物活性測定方法。常用的生物學活性測定包括：ADCC、CDC、抑制細胞增殖、細胞毒性、細胞因子分泌能力、內化作用等。

抗體依賴性細胞介導的細胞毒性

（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity ,ADCC）

抗體藥物的Fc段通過與效應細胞（最主要是NK細胞）表面的Fc受體（如FcγRIIIa/CD16）結合，介導效應細胞殺傷腫瘤細胞。因而經典的ADCC檢測方法是制備外周血單個核細胞（PBMC），直接進行效應細胞殺傷實驗。但是因為PBMC本身異質性強，整個操作過程繁瑣，結果背景高，會對評價實驗結果帶來諸多不便。

抗體依賴性細胞介導熒光素酶報告基因法-ADCC：抗體Fc段結合FcR會激活NFAT信號通路，因而近年來開始使用熒光素酶報告基因法來進行ADCC評價。比如CD20抗體ADCC評價，使用WIL2-S細胞系作為靶細胞，使用基因工程改造的Jurkat細胞作為效應細胞，該細胞表達FcγRIIIa和NFAT應答元件驅動的熒光素酶報告基因，當抗體將效應細胞和靶細胞連接在一起時，NFAT被激活，通過熒光素酶化學發光信號可以反映抗體的ADCC效應，此方法簡單、專屬性好、細胞系均一性好、準確度高。

抗體依賴性細胞介導的細胞毒法-ADCC：抗體的Fc段和經過改造NK細胞的FcγR結合使NK細胞激活，誘導效應分子的釋放，其中包括穿孔素、顆粒酶和腫瘤壞死因子等誘導細胞凋亡。適用抗體藥物：CD20抗體、CD38抗體、HER2抗體、GD-2抗體等

補體依賴的細胞毒性CDC

Complement-dependent cytotoxicity (CDC)

抗體藥物的Fc和補體C1q結合，會在靶細胞表面形成膜攻擊復合體（membrane attack complex，MAC)，造成細胞外離子大量內流，引起腫瘤細胞裂解。

CDC活性測定，是將重組抗體進行系列稀釋后，與靶細胞進行孵育，在補體存在的情況下，抗體藥物會在靶細胞表面形成膜攻擊復合體，導致細胞溶解，采用檢測細胞存活的試劑，可以對CDC作用效果進行評價。

適用抗體舉例：CD20抗體、CD38抗體、CD52抗體等。

細胞增殖抑制實驗
 

生長因子類靶點（如VEGF、HER2、EGFR）的抗體藥物，通常通過阻斷靶點和其受體的結合，從而抑制生長。因而在進行生物學活性測定時，可以采用細胞增殖抑制實驗來測定。如貝伐珠單抗（VEGF抗體）可以使用人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖抑制法，曲妥珠單抗（HER2單抗）可以使用表達HER2的乳腺癌細胞系進行增殖抑制實驗，如BT474等。西妥昔單抗（EGFR抗體）可以使用表達EGFR的腫瘤細胞系，如A431等。

細胞因子測定
 

如前文所述，PD-1抗體或者PD-L1抗體，可以阻斷PD-1和PD-L1的結合，恢復T細胞的效應功能。T細胞分泌系列細胞因子如TNF-α、IFN-γ等的能力增強，因而檢測細胞因子分泌可以反映抗體藥物的生物活性。

檢測細胞因子有多種方法，其中最簡單的細胞因子測定方法是ELISA法，可以通過檢測細胞分泌上清中的單個細胞因子。也可以使用ELIspot和流式細胞術檢測分泌細胞因子的細胞。有時為了更好評價抗體藥物的功能，需要檢測一個細胞因子panel，則可以選用流式細胞術CBA法或Luminex液相芯片技術。如果對于靈敏度有要求，則可以考慮選擇電化學發光法。
 

綜合活性測定

抗體藥物通過Fab段CDR區結合抗原，Fc段結合FcR，結合C1q，結合FcRn等，是抗體發揮其生物學活性的基礎，因而測定抗體的結合活性，可以部分反映抗體的活性。常用的方法包括表面等離子共振測定，生物膜層干涉法，時間分辨熒光和apha技術等。

表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance）測定法

Wood等人在1902年發現了由表面等離子體波激發引起的異常衍射現象。表面等離子共振，是指光源發出的一束入射光從高折射率介質射向低折射率介質的界面時，如果入射角大于一定的臨界角，入射光將被100%地發射至光源的同一側，這叫做全內反射現象，當兩種介質之間有一層金屬膜時，入射光的能量將會引起金屬膜中等離子體共振，并以電磁場的方式彌散至低折射率介質一側，從而導致反射光的能量在某個特定的角度降至最低，這一角度稱為SPRdip角。

任何藥物發揮作用都涉及到藥物和靶點分子之間的結合，而表面等離子共振作為一種生物傳感器技術，在此領域有廣泛的應用。

當分子間發生結合或者解離時，會定量改變膜表面附近分子的濃度，從而導致金屬膜附近折射率的變化，導致SPRdip角發生改變，因而通過實時監測角度變化，可以檢測結合和解離過程。

Adv Protein Chem Struct Biol . 2018;110:1-30.

生物膜層干涉（Bio-Layer Interferometry ,BLI）測定法
 

生物膜干涉技術（BLI）實時監測分子間相互作用是通過生物傳感器來實現的，生物分子A結合到光纖材質的生物傳感器末端會形成一層生物膜，當傳感器末端的分子A與待檢測分子B結合時會引起傳感器末端分子量的改變，從而導致生物膜厚度的改變。光通過傳感器的生物膜層后會發生透射與反射，反射光的頻率受到生物膜層厚度的影響。一些頻率的反射光會與入射光產生相長或相消干涉。這些干涉光波被光譜儀所檢測到，并形成一幅干涉光譜,并以干涉光譜的相對位移（nm）顯示出來。因此，結合到傳感器表面的分子一旦有數量上的增減，光譜儀便會實時地檢測到干涉光譜的位移，而這種位移直接反應出傳感器表面生物膜的厚度。

均相時間分辨熒光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence HTRF）
 

HTRF結合了熒光共振能量轉移（FRET）和時間分辨熒光（TRF）兩種技術，具有背景低，靈敏度高，通量大等特點。當供體和受體（可以理解為抗體和抗原或者抗體和受體）距離較近時，供體和受體之間發生熒光共振能量轉移而產生信號。因為采用雙波長檢測，能夠顯著減少緩沖液，培養液等的干擾。

總 結

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