注：本文不構成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準；本文僅作醫療健康相關藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表平臺立場。任何文章轉載需得到授權。
皓陽生物基于可商業化授權的CHO-K1細胞株，結合自有的質粒系統以及細胞株篩選方案，建立皓越®穩定細胞株平臺，2021年至今已為國內外客戶完成超過50個單抗、雙抗以及融合蛋白穩定細胞株構建項目。在常規培養條件下，項目平均表達量大于6.7g/L，高效助力客戶項目更快更好推進。2022年，基于皓越®的基礎上進一步打造Fut8敲除的ADCC加強型穩定細胞株構建平臺，為客戶提供更多元的選擇與服務。皓越®以成為全球穩定細胞株構建的第一品牌為愿景，幫助客戶贏在CMC起點，堅持精益求精的品質，為每一位客戶聚力，為每一個項目賦能。
現在，皓陽正式推出“4g保底，挑戰無上限”的穩定細胞株開發服務！為對稱結構的單/雙抗提供4g/L的保底細胞株構建服務。為實現全球穩定細胞株構建第一品牌的愿景，歡迎客戶將皓陽的服務同步與國內外任何同行做同步對比。
雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）是一類能識別兩種位點或能與兩種抗原進行結合的非天然抗體結構，從由linker連接的兩個最小抗原結合片段，到IgG結構基礎上交聯額外的結構域的“大型”分子，科學家們的奇妙構思造就了琳瑯滿目的精巧架構，賦予了理論上“1+1大于2”的能力——bsAb能表現出單獨的親本抗體或混合的“雞尾酒療法”不可比擬的性質和潛力。如在最為廣泛的應用領域之一——腫瘤的免疫治療上，bsAb能同時結合兩個位點，發揮阻斷腫瘤細胞信號通路，介導免疫細胞殺傷靶細胞等功能，降低單抗的“脫靶”效應，減少腫瘤細胞逃逸。由于bsAb的種種優越性，近年來一直受到業內的高度關注，也成為癌癥，炎癥，自身免疫病等多種疾病的開發熱點。
隨著行業發展，從第一個上市的Catumaxomab起，Amgen的Blinatumomab和Roche的Emicizumab相繼獲批，近期國家藥品監督管理局（NMPA）官網公示，由康方生物自主研發的PD-1/CTLA-4 雙特異性抗體Candonilimab獲批上市?？梢灶A見，未來的賽道上涌現的bsAb明星將會越來越多，而將一個promising的bsAb從實驗室推動到臨床及上市，真正造?；颊?，從CMC的角度，需要高屋建瓴的設計與思考。
通過剖析與歸納bsAb的結構，可分為具備Fc區的IgG-like bsAb及不具備Fc區的non-IgG-like bsAb，其中IgG-like bsAb又分為對稱（Symmetric）和非對稱結構（Asymmetric）。Catumaxomab和Emicizumab是IgG-like bsAb的典型代表，這類bsAb在CMC上的優勢在于溶解性和穩定性較好，劣勢在于有些復雜結構會帶來較高的聚體、錯配、得率低等問題；Blinatumomab則屬于non-IgG-like bsAb一類，這類bsAb在CMC上的優勢在于結構簡單，一般表達量較高，劣勢則在于需要開發特定的純化技術路線等。
如何能在IND階段順利完成bsAb的開發工作，需要從以下幾個重點考慮：
01 細胞株開發
基于QbD理念及現實因素考慮，對于整個CMC而言，一個“天資卓越”的細胞株重要程度不言而喻，它是整個CMC的起點和基礎。高效穩定細胞株兼具表達量高，產品質量好（錯配/聚體低等），穩定性好等特性。這些特性直接影響到后續工藝開發、生產可及性和生產成本的控制。皓陽在2021~2022年間開發的15個bsAb項目，涵蓋7種不同結構的經驗，見圖1。目前針對bsAb的細胞株開發，皓陽多維度做了更多的考慮和設計，主要體現在表達載體設計、宿主細胞選擇、檢測方法和篩選方式的設計和選擇上。
（注：商業化CD培養基常規14天Fed-batch培養工藝，；紅點為Top clone titer；綠點為Top pool titer。）
針對不同結構的bsAb個性化的載體構建策略，在細胞株開發早期高通量的檢測bsAb的純度和正配率，在細胞株篩選過程中確定關鍵指標和技術點，以盡可能的保障能篩選到表達較優bsAb的細胞株，一個Asymmetric formats bsAb開發實例如下：
通過轉染及高通量minipool篩選，得到一批細胞群，表達及質量情況如下表
其中minipool B在正配率和表達量上較其余minipool有顯著優勢，SEC純度在可接受范圍內，挑選minipool B進行單克隆篩選，細胞株表達及一步親和純化后質量情況如下表
由此可見，通過前期獲得正配率較高，表達量較優的細胞群，后續篩選出理想的細胞株概率大幅提升，極大程度的減低了該Asymmetric formats bsAb后續工藝開發的難度。
02上游工藝開發
誠然，獲得一個表達高質量蛋白的細胞株對于bsAb后續開發是相對事半功倍的，但往往會存在沒有篩到理想細胞株的情況。細胞株開發是相對耗時費力的限速步驟，反復重復該部分工作，結果的不確定性極大，因此帶來難以考量時間和經濟成本。上游工藝開發可及時介入，以期通過后天的培養條件優化改善產物質量，一個開發實例如下。
如圖1中結構1所展示的Symmetric formats bsAb，由于分子結構的復雜性導致蛋白分泌時出現斷裂，且碎片無法經純化有效的去除，針對該熱門靶點結構分子，不同公司采取了不同的處理手段，如通過對細胞因子序列的改造減少斷裂（WO2018205985A1）。該項目在未經序列優化的情況下，通過高通量細胞株篩選對于斷裂情況無有效改善，在選定top clone后，結合培養基開發和細胞培養工藝優化，成功降低了bsAb斷裂比例，對碎片含量進行了有效控制，提高了純化收率。后續三批中試生產收率達到65%-70%，與單抗基本一致。
圖2 Symmetric formats bsAb SEC overlay
其中Tpp為克隆篩選，AP3 01-AP3 04 為不同培養條件下的3L反應器培養
03 下游工藝開發
與單抗相比，bsAb具有更加多樣化的分子結構與更加復雜的副產物，如同源二聚 （Homodimer）、重-輕鏈錯配（Heterodimeric Fc species）、半抗（Half antibody）、輕鏈二聚體、重鏈二聚體（light chain dimer，heavy chain dimer）等，對下游純化工藝提出了更高的挑戰?，F階段bsAb的純化策略依然主要依賴于層析技術。不同于單抗的經典三步層析策略，bsAb沒有固定的純化套路，一個好的bsAb純化策略需同時考慮副產物去除、目的蛋白收率、成本以及工藝的可放大性。
快速有效的完成bsAb純化策略研究，首先需要了解目的蛋白的分子結構與性質，知己知彼，方能百戰不殆。bsAb通常具有特殊的分子設計，以提高其正確配對率，減少副產物的產生。有時可以增加bsAb與副產物之間的差異性，提高層析步驟的分辨率；其次根據已有的平臺方法，選擇合適的層析工藝去除雜質；最后整體考量工藝對雜質的去除能力，制定純化策略。一般的純化工藝包含捕獲、粗純、精純三個步驟。在bsAb純化策略的制定上也可對其進行借鑒，評估每個層析工藝對不同雜質的去除能力，考慮每個步驟輸入條件與輸出結果，有效連接各個層析工藝，從而達到制備合格產品的目的。一個Asymmetric formats bsAb開發實例如下。
通過高通量細胞株篩選，獲得的細胞株表達量較高，但蛋白質量與原研有所差異。通過下游工藝去除錯配體，精純后蛋白質量與原研高度相似。
圖3 Asymmetric formats bsAb CEX overlay
bsAb作為抗體治療領域的新興概念，受到持續且矚目的關注。多家企業已進行bsAb的戰略化布局，雖然目前多數處于研發階段，但可以預見后續的bsAb賽道將會越來越擁擠。而克服bsAb產業化過程中面臨的種種挑戰，需要各方攜手并進，通盤考慮。相信未來會有更多的療效強、副作用低的bsAb進入市場，為患者帶來更多的選擇和希望。
參考文獻
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關于皓陽生物
杭州皓陽生物技術有限公司成立于2015年，專注于為抗體/重組蛋白客戶提供早期成藥性評估、抗體藥物偶聯開發、穩定細胞株構建、工藝開發、中試生產、IND申報和臨床樣品生產，培養基開發定制等多平臺一站式研發服務。在上海杭州兩地設有研發中心和生產基地，目前擁有員工200余人。上海研發中心依托多種分析手段和瞬時表達平臺為客戶提供從人源化設計，活性分析到成藥性分析多維度的分子設計和評估。杭州中心擁有自主開發可授權的高表達穩定細胞株平臺（皓越）和工藝開發平臺，建有完善的250L和500L規模原液和成品GMP生產線，能夠在8個月左右提供從DNA到毒理批樣品交付，12-15個月內完成IND申報準備工作。同時公司還在建6*2000L商業化生產線，預計于2024年底陸續投入使用。皓陽生物致力于通過幫助新藥研發，推動生物醫藥領域的進步，實現創新為民、科技惠民的目標。
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