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近年來，生物醫藥領域增長迅速，其中抗體藥物由于其特異性、高效性和安全性等特點，已被廣泛應用在在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、新冠肺炎等重大疾病中，并成為國際制藥業競爭的焦點。
不同于合成藥物，抗體藥物的生產主要利用的是哺乳動物細胞表達系統，其中中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是重組蛋白生產的首要選擇。整個生產過程如圖1所示，大體分為四個部分：
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細胞表達抗體
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收集上清液
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分離純化抗體蛋白
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藥物產品制劑化
其中，抗體的細胞表達水平隨著抗體工程技術的發展得到了顯著提高，大大降低了規?；毎囵B的成本。
然而，生物料液的復雜性及對抗體產品要求的嚴格性使抗體純化等下游加工環節成為了抗體生產的關鍵，約占抗體生產成本的50%～80%。
圖1 抗體藥物生產的簡要流程圖
現階段對于下游加工環節的關注點主要集中在兩個方面：料液預處理和抗體純化。
高活細胞密度生產高滴度抗體蛋白的工藝會產生更高濃度的固體顆粒和亞微米級的細胞碎片。傳統的離心工藝很難將其除去，最終會導致微濾系統或下游的收獲過濾系統結垢，過濾效率大打折扣，并且會造成產品的損失。
抗體純化階段使用最廣泛的是親和層析技術。它對生物分子選擇性的吸附和分離，可以取得很好的純化結果。但由于載體較昂貴，配基與載體耦聯條件激烈等缺點使其應用于大規?？贵w生產中存在諸多困難。
鑒于此，絮凝技術和沉淀技術被開發應用于抗體生產中，以期望能解決上述難題。
絮凝技術是利用細胞和細胞碎片在細胞培養液中帶有輕微的負電荷，因此可以利用聚陽離子聚合物結合帶負電荷的細胞和細胞碎片，形成較大的顆粒。這些顆粒很容易發生自身沉降，從而使得上清液具有更高的過濾速率以及更低的產品損耗[1]。
沉淀技術是利用聚乙二醇、金屬離子等試劑使溶液中的抗體蛋白形成蛋白簇，隨后利用切向流過濾技術對抗體蛋白進行過濾回收，最終在產量和純度方面可以獲得與親和層析色譜相似的結果。這體現出沉淀技術具有高度的競爭力[2]。
在上述的兩種技術中，形成的顆粒尺寸大小和分布對于工藝而言是重要的優化因素。因此，引入實時顆粒分析系統優化工藝條件，提高生產效率并降低生產成本是必要的。
梅特勒托利多的實時顆粒分析儀器（圖2）——ParticleTrack G400（聚焦光束反射測量技術（FBRM））和EasyViewer 100（在線顆粒成像分析技術）可以幫助研究人員實時動態監測顆粒生成過程，從而理解過程參數對顆粒性質的影響。兩者在單抗生產中的安裝方式如圖1所示。
圖2 梅特勒托利多在線分析儀器——ParticleTrackG400（左圖）、EasyViewer100（右圖）
近年來，有學者借助這些先進的儀器進行了相關的研究并進行了報道。
絮凝劑在與細胞碎片等發生絮凝時形成的顆粒大小和尺寸分布會受到絮凝劑種類與添加策略等因素的影響，進而對過濾效率造成影響。
安進公司純化工藝開發部門[3]開發了一種新穎且簡單的雙聚合物絮凝方法，用于從高細胞密度的細胞培養過程中收獲單克隆抗體。在實驗中，研究人員利用ParticleTrack G400來監測體系中不同絮凝劑加入后顆粒數量和大小的變化情況，從而判斷絮凝策略的有效性。
結果顯示，在只加入聚陽離子聚合物聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDADMAC)后，體系中小于10微米的顆粒數從88增加到28117個顆粒/秒，提升了兩個數量級之多。
從中可以看出，體系中包含了很多低于儀器檢測限0.5微米的顆粒，PDADMAC可以將這些亞微米細胞碎片顆粒絮凝，形成更大的、更易檢測的絮凝顆粒，去除這些亞微米顆?？梢詫⒛み^濾通量提高至少6倍，顯著改善了深度過濾的效率，這表明絮凝策略的有效性。
此外，根據Stokes定律，由于沉降速度與顆粒大小的二次方成正比，因此提高絮凝顆粒大小是一種有效的策略。研究人員利用儀器對比了單絮凝劑和雙聚合物的絮凝效果，結果顯示絮凝顆粒的大小從25微米增大至87微米，從而進一步提升了上清液過濾的效率。
利用試劑沉淀上清液中的抗體蛋白時，試劑的種類，添加策略、溶液的pH等對于沉淀結果都有著不小的影響。
諾華塞公司藥物創新部門[4]利用PEG6000進行沉淀純化抗體蛋白時，發現不同的添加策略會形成不同粒度分布的蛋白簇，這會直接影響下一步切向流過濾的效率。研究人員利用ParticleTrack G400探索了不同的滴加模式和時間對形成的抗體蛋白粒度分布的影響。
從圖3中可以看出，與3、5或15分鐘的添加時間相比，單次添加20%PEG的弦長分布范圍更大，這意味著下一步的過濾步驟需要同時處理大顆粒和小顆粒，這對于追求效率的工藝步驟而言顯然是不能接受的。
更長添加時間的策略可以控制生長并限制顆粒成核，從而獲得所需尺寸和尺寸分布，以增加固液分離的效率。這將最大限度地減少過濾過程中的困難，因為過濾膜的孔徑可以更好針對窄粒度分布，以此對過濾速率進行優化。
圖3 mAb1在不同PEG6000添加時間下粒徑分布圖
除了添加策略對沉淀蛋白有影響，體系pH值同樣發揮著不可忽略的作用。
維也納農業大學研究人員[5]利用ZnCl2作為沉淀試劑配合切向流過濾回收沉淀蛋白時發現，金屬離子沉淀蛋白的過程中，產率和蛋白顆粒粒度分布很容易受到溶液pH值的影響。為了量化pH值的影響，研究人員在12mM ZnCl2的條件下改變pH值進行沉淀實驗，其中利用ParticleTrack G400監測生產的蛋白顆粒粒度分布情況。
產率結果如圖4A所示，蛋白顆粒粒徑分布如圖4B-D所示。從結果中可以看出，對于所有重組抗體，沉淀的最佳pH值約為pH6和7，其中最特殊的情況是地諾單抗，僅在pH7時具有較高的沉淀產率。粒徑分布受pH的影響和產率類似，在產生較大粒徑分布的pH條件也是具有更好產量的條件。
因此，在工業生產中，這意味著ParticleTrack G400在線監測可用于估算所得產率，而無需離線測量沉淀期間的實際濃度。
圖4 (A)不同抗體在不同pH值下的沉淀產率。黑色圓圈阿達木單抗、藍色三角形曲妥珠單抗和紅色方塊地諾單抗。(B-C-D)阿達木單抗、曲妥珠單抗和地諾單抗的粒徑分布圖。黑色虛線pH8、藍色實線pH7和紅色虛線pH6。
綜上所述，細小的細胞碎片顆粒物和昂貴的色譜層析純化方法是抗體藥物的大規模生產的兩大痛點。梅特勒托利多的實時顆粒分析系統能夠幫助企業追蹤各因素對絮凝技術和沉淀技術中顆粒的變化影響，進而可以快速優化工藝，節省下游生產成本，實現高效穩定的抗體藥物生產。
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References
[1] Burgstaller D, Krepper W, Haas J, et al. Continuous cellflocculation for recombinant antibody harvesting[J]. Journal ofChemical Technology & Biotechnology, 2018.
[2] Sommer R, Tscheliessnig A, Satzer P, et al. Capture andintermediate purification of recombinant antibodies with combinedprecipitation methods[J]. Biochemical Engineering Journal, 2015, 93: 200-211.
[3] Mcnerney T, Thomas A, Senczuk A, et al. PDADMAC flocculation ofChinese hamster ovary cells: Enabling a centrifuge-less harvestprocess for monoclonal antibodies[J]. Mabs, 2015, 7(2).
[4] Royo M, Beulay J L, Valery E, et al. Mode and dosage time inpolyethylene glycol precipitation process influences proteinprecipitate size and filterability[J]. Process Biochemistry, 2022, 114: 77-85.
[5] Dutra G, Komuczki D, Jungbauer A, et al. Continuous capture ofrecombinant antibodies by ZnCl2 precipitation without polyethyleneglycol[J]. Engineering in Life Sciences, 2020.
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